| 수정란 이식산업에 있어서 수정란의 성을 판별하여 수란축에 이식할 수 있다면 산업적인 효과는 물론 학술적으로도 대단한 기여를 하게 될 것이다. 즉 공란우에 다배란 처리를 하고 발정시 X- 혹은 Y-염색체를 가진 정자를 선택적으로 인공수정하게 되면 쉽게 후대의 성을 완벽히 조절하여 생산할 수 있다. 몇몇 연구자들에 의해 X와 Y 정자를 분리하였다는 보고가 있으나, 산업적으로 X와 Y정자를 선택적으로 인공수정하는데는 아직 많은 문제를 갖고 있다. 따라서 이식하기 전에 수정란의 성을 판별하여 수란축에 이식함으로서 인위적으로 원하는 성의 자축를 생산하려는데 많은 연구가 집중되고 있다. 이식전 수정란의 성을 판별하는 방법으로 성 염색체 분석법, X-linkage enzyme activity 측정법, H-Y 항체이용법등이 있으나 정확도가 비교적 높지 않으며 전문적인 기술이 필요하고 시간이 많이 소요되는 문제가 있다. 그리고 이런 방법으로 성판별할 경우 역시 수정란에 치명적 손상을 줄 우려가 있어 실용화하기에는 아직도 해결해야 할 문제점들이 많이 있다. | |||||||||||||||||
| 1. PCR기법에 의한 성판별 | |||||||||||||||||
| 1990년대들어 Y 염색체 특이적 DNA primer를 이용하여 Y 염색체상의 특정 부분을 수십만배 증폭하는 중합효소연쇄반응(PCR; polymerase chain reaction)기법이 발달되면서 소, 면·산양, 돼지 및 사람 등의 수정란을 100% 정확히 성판별하는 기술이 개발되었다. 일부 축산 선진국에서는 이미 PCR기법에 의해 성판별한 수정란으로 송아지가 생산되었으며, 우리나라에서도 송아지의 생산이 보고되었다. 그러나 PCR기법에 의한 수정란 성판별시 Y 염색체 특이적 DNA primer의 종류, 사용하는 primer의 농도, 수정란의 할구세포의 수, PCR 반응조건 등 연구자에 따라 다소 다른 결과를 얻고 있으며, 특히 PCR기법은 대단히 민감하고 특이하기 때문에 성판별에서 많은 오류를 범할 수 있다. 여기에서는 이식하기전 수정란의 성을 빠르고 정확히 판별하기 위한 PCR기법에 대하여 소개하고자 한다. | |||||||||||||||||
| 가. 수정란의 성판별을 위한 Y 염색체 특이적 DNA primer제조 | |||||||||||||||||
| 소의 성은 정자에 의해 수정시 난자가 X- 정자와 수정되면 암송아지로, Y- 정자와 수정되면 숫송아지로 결정되기 때문에 수정란내에 Y- 혹은 X- DNA 존재여부를 알 수만 있다면 곧바로 암수의 수정란을 확인할 수 있다. 따라서 수정란내의 Y-DNA만을 선택적으로 증폭시켜 증폭되는 물질이 없으면 암컷, 증폭되는 물질이 존재한다면 수컷으로 확인되기 때문에 수정란의 성판별에 가장 중요한 것은 Y 염색체 특이적 DNA primer를 제조해내는 것이다(그림 1, 2). | |||||||||||||||||
| 표 1. 소 수정란의 성을 판별하는데 널리 쓰이는 primer | |||||||||||||||||
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그림 1. PCR을 위한 DNA증폭장치 | |||||||||||||||||
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그림 2. 소 수정란 성판별에 사용하는 primer | |||||||||||||||||
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1과 5번 : Y염색체 특이적 DNA primer | |||||||||||||||||
| 나. 소 수정란의 할구분리 및 배양 | |||||||||||||||||
| 이식전 수정란의 성을 판별하고 이식하기 위해서는 최소의 할구세포를 분리하여 PCR기법으로 수정란의 성을 판별하고 나머지는 배양 혹은 이식에 사용하여야 한다. 수정란의 미세분리는 배반포 이상의 수정란을 수정란 미세분리기를 이용하여 영양아세포의 일부(할구세포 5~10개)를 분리하여야 한다. 분리할구는 TCM 199 배양액에서 1시간여를 배양한 다음 발정이 동기화된 암소의 자궁각 깊이 이식해야한다. 분리된 할구세포는 준비한 PCR 반응액을 이용하여 30 cycle을 증폭시키고 2%의 agarose gel을 만들어 100V로 전기영동 한다. 전기영동후 PCR산물을 확인하면 141bp에서만 특이적 DNA band가 보이면 수컷으로 그리고 216bp에서만 DNA band가 보이면 암컷으로 판정한다(그림 3). | |||||||||||||||||
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그림3 . PCR 기법에 의한 소 수정란의 성 판별 | |||||||||||||||||
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1, 3, 5, 7 및 9번 : 수놈 수정란 2, 4, 6, 8 및 10번 : 암놈 수정란 | |||||||||||||||||
| 다. PCR 기법을 이용한 이성쌍자의 프리마틴 조기 진단 | |||||||||||||||||
| 최근 수정란 이식 혹은 자연상태에서 쌍자생산시 암송아지는 번식이 안되는 프리마틴이 발생되나 어렸을 때에는 육안적으로 쉽게 프리마틴 여부를 진단할 수 없고 가장널리 쓰이는 방법이 염색체 검사법이었다(그림 4). 그러나 염색체 검사는 장시간의 소요되고 간혹 염색체 분석사의 오류에 의한 오진이 있게된다. 그러나 2㎖정도의 프리마틴 혈액으로 DNA를 쉽게 추출하여 Y 염색체 특이적 DNA primer를 이용하면 100% 정확히 프리마틴을 진단할 수 있다(그림 5). | |||||||||||||||||
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